고해상도 현미경의 주요 발전

하이델베르크에 있는 막스 플랑크 의학 연구소의 노벨상 수상자 스테판 힐이 이끄는 과학자들은 밀리초당 1나노미터의 공간적 및 시간적 해상도를 가진 초고해상도 현미경을 개발했습니다. 최근 도입된 초고해상도 MINFLUX 현미경의 개선된 버전을 통해 전례 없는 수준의 세부 사항으로 단일 단백질의 작은 움직임을 관찰할 수 있었습니다. 에서 작품이 출판되었습니다. 과학단백질에서 나노미터 크기의 형태 변화를 모니터링하기 위한 혁신적인 새로운 도구로서 MINFLUX의 힘을 강조합니다.

세포의 내부 작용을 밝히려면 개별 단백질의 생화학 지식이 필요합니다. 위치와 모양의 작은 변화를 측정하는 것이 여기에서 핵심 과제입니다. 형광 현미경, 특히 초고해상도 현미경(즉, 나노스코피)은 이 신흥 분야에서 없어서는 안 될 요소가 되고 있습니다. 최근 선보인 형광 나노스코프 시스템 민플럭스(MINFLUX)는 이미 작은 유기분자 크기인 나노미터에서 수 나노미터의 공간 분해능을 달성했다. 그러나 분자 세포 생리학에 대한 우리의 이해를 다음 단계로 끌어올리려면 훨씬 더 높은 시공간 분해능을 가진 관찰이 필요합니다.

Stefan Hell의 그룹이 2016년에 MINFLUX를 처음 도입했을 때 MINFLUX는 세포에서 형광 표지된 단백질을 추적하는 데 사용되었습니다. 그러나 이러한 움직임은 무작위적이었고 추적의 정확도는 수십 나노미터 정도였습니다. 그들의 연구는 MINFLUX의 분해능을 단백질, 특히 운동 단백질 키네신-1의 형태 변화에 적용한 최초의 연구입니다. 이를 위해 Max Planck Institute for Medical Research의 연구원들은 단일 형광 분자를 추적하기 위한 새로운 버전의 MINFLUX를 개발했습니다.

단백질 역학을 측정하기 위해 확립된 모든 방법에는 심각한 제한이 있어 (sub)nm/(sub)밀리초 범위를 다루는 능력을 방해합니다. 일부는 몇 나노미터까지 높은 공간 분해능을 제공하지만 변경 사항을 충분히 빠르게 추적할 수 없습니다. 다른 것들은 시간 분해능이 높지만 연구 중인 단백질보다 2~3배 더 큰 구슬로 라벨링해야 합니다. 단백질의 기능은 이 크기의 비드에 의해 손상될 가능성이 있기 때문에 비드를 사용한 연구는 미해결 질문을 남깁니다.

단일 분자의 형광

그러나 MINFLUX는 단백질 결합 마커로 표준 1nm 크기의 형광 분자만 필요하므로 고유 단백질 역학을 연구하는 데 필요한 분해능과 최소 침습성을 제공할 수 있습니다. Otto Wolf 박사는 “도전 과제 중 하나는 이론적 한계에 가깝게 작동하고 환경 소음으로부터 보호되는 MINFLUX 현미경을 구축하는 것입니다. 그룹의 학생. “단백질 기능에 영향을 미치지 않고 생물학적 메커니즘을 드러내는 탐침을 설계하는 것은 또 다른 문제입니다.”라고 그의 동료인 Lukas Scheiderer는 덧붙입니다.

연구진이 도입한 MINFLUX 현미경은 이제 밀리초당 1.7나노미터의 시공간 해상도로 단백질 움직임을 기록할 수 있다. 감지에는 형광 분자에서 방출되는 약 20개의 광자만 필요합니다. Stefan Hill은 “개별 단백질의 역학 및 단백질이 작동하면서 모양이 어떻게 변하는가에 대한 연구에서 새로운 장을 열었다고 생각합니다.”라고 말했습니다. “MINFLUX가 제공하는 높은 공간적 및 시간적 해상도의 조합을 통해 연구원들은 이전과는 전혀 다른 방식으로 생체 분자를 연구할 수 있습니다.”

생리학적 조건 하에서 ATP로 kinesin-1의 단계적 작용 해결

Kinesin-1은 우리 세포를 통해 화물을 운반하는 핵심 역할을 하며 단백질 돌연변이는 많은 질병의 핵심입니다. 사실, 키네신 1은 마치 거미줄처럼 우리 세포 위로 뻗어 있는 필라멘트(미소소관)를 따라 “걷습니다”. 단백질에는 미세 소관에서 위치를 번갈아 변경하는 두 개의 “머리”가 있기 때문에 움직임을 문자 그대로 “걸음”으로 상상할 수 있습니다. 이 움직임은 일반적으로 미세소관을 구성하는 13개의 기본 필라멘트 중 하나를 따라 발생하며 세포의 주요 에너지원인 ATP(아데노신 삼인산)의 분해에 의해 연료가 공급됩니다.

단 하나의 형광단을 사용하여 키네신-1에 라벨을 붙인 과학자들은 나노미터/밀리초 시공간 분해능으로 개별 머리에 대해 정상 16nm에 8nm를 더한 단계를 기록했습니다. 그들의 발견은 하나의 머리가 미세소관에 부착되는 동안 ATP가 흡수되지만 두 머리가 결합될 때 ATP의 가수분해가 일어난다는 것을 보여주었습니다. 또한 이 단계는 페이로드를 운반하는 키네신 분자의 일부인 단백질 ‘줄기’의 회전과 관련이 있음을 밝혔습니다. MINFLUX의 시공간적 해상도 역시 각 단계의 초기 단계에서 머리 회전을 드러냈습니다. 놀랍게도 이러한 결과는 형광 마이크로 라벨을 사용하여 아직 가능하지 않은 ATP의 생리학적 농도를 사용하여 이루어졌습니다.

“MINFLUX가 우리를 어디로 데려갈지 기대됩니다. 단백질이 어떻게 작용하는지에 대한 연구에 또 다른 차원을 추가합니다. 이를 통해 많은 질병의 메커니즘을 이해하고 궁극적으로 치료법 개발에 기여할 수 있습니다.”라고 Jessica Mathias는 덧붙입니다. 이전에 Hell 그룹에 속해 있던 박사후 연구원으로 현재 다양한 생물학적 질문에 MINFLUX를 적용하는 방법을 모색하고 있습니다.